Пцр-идентификация локусов солеустойчивости в селекционном материале риса для создания солеустойчивых сортов

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
      Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
      высшего образования
     «КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
     (ФГБОУ ВО «КубГУ»)
     
     Кафедра биохимии и физиологии
     
     
                                   ДОПУСТИТЬ  К ЗАЩИТЕ  В  ГЭК
                                   Заведующий кафедрой – канд. биол.
                                   наук, доцент ________ В. В. Хаблюк
                                   «___»______________ 2016 г.
     
     
     
     
     ВЫПУСКНАЯ  КВАЛИФИКАЦИОННАЯ  РАБОТА
     БАКАЛАВРА
     
     
     ПЦР-ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЛОКУСОВ СОЛЕУСТОЙЧИВОСТИ В СЕЛЕКЦИОННОМ МАТЕРИАЛЕ РИСА ДЛЯ СОЗДАНИЯ СОЛЕУСТОЙЧИВЫХ СОРТОВ
      
      
      
Работу выполнил _______________________________________ Ю.А. Макуха
                                                                      (подпись, дата)
      
Факультет биологический
     
Направление 06.03.01 Биология
     
Научный руководитель,
зав. каф., канд. биол. наук,
доцент ________________________________________________ В. В. Хаблюк
                                                                    (подпись, дата)
      
      
Нормоконтролёр,
доцент,  канд. биол. 
наук _________________________________________________ Н. Н. Улитина
                                                                     (подпись, дата)
                                        
      
     Краснодар 2016
РЕФЕРАТ
     
      Выпускная квалификационная работа 41с., 3 гл., 6 рис., 2 табл., 43 источника.
     ДНК-МАРКЕРЫ, ЛОКУСЫ СОЛЕУСТОЙЧИВОСТИ, ГЕНЕТИКА РИСА, ПЦР-АНАЛИЗ, МИКРОСАТЕЛЛИТЫ
     Объектом исследования послужило 28 сортов и сортообразцов риса, включая два солеустойчивых образца, предоставленные лабораторией  ФГБНУ «ВНИИ риса».
     Цель работы — выявить локусы солеустойчивости в селекционном материале риса с помощью ПЦР-анализа для создания солеустойчивых сортов.
         В данном исследовании использовался метод ПЦР-анализа с применением микросателлитных маркеров и метод электрофореза для разделения и визуализации продуктов амплификации.
     В результате исследования выяснилось, что микросателлитные маркеры RM493, AP3206 являются пригодными для ранжирования генетической плазмы риса по признаку солеустойчивости, и сорта Курчанка и Маржан являются наиболее перспективными при селекции риса на солеустойчивость.


ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ, СОКРАЩЕНИЯ

ПЦР - полимеразная цепная реакция
bp - base pair - пара нуклеотидов (оснований); элементарная единица двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты 
CTAB - ЦТАБ - Цетилтриметиламмоний бромид 
dNTP mix -  смесь дезоксирибонуклеозидфосфатов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
10x buffer - р-р сульфатов и бычий сывороточный альбумин
TE buffer - Tris/EDTA -  буферный раствор, содержащий смесь Трис-основание и ЭДТА
EDTA - ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
rpm - revolutions per minute - оборот в минуту (об/мин)
     


     СОДЕРЖАНИЕ
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
5
1 Аналитический обзор . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 

    1.1 Биология риса (Oryza sativa) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
7
    1.2 Общие сведения о генетике риса . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
    1.3 Проблема  солеустойчивости  риса . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
    1.4 Использование полимеразно-цепной реакции в генетических исследованиях . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
13
    1.5 Типы ДНК-маркеров . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
    1.6 Локусы солеустойчивости риса . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
    1.7 Лабораторный метод оценки солеустойчивости риса. . . . . . . . . . . . . . . .
21
    1.8 Конечный метод оценки риса на солеустойчивость. . . . . . . . . . . . . . . . .
22
2 Материал и методы исследования . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
24
    2.1 Объект исследования . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
24
    2.2 Растворы и буферы. Оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
24
    2.3 Подготовка растительного материала и экстракция ДНК . . . . . . . . . . . . 
25
    2.4 Полимеразная цепная реакция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
    2.5 Электрофорез . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
27
    2.6 Метод оценки риса на солеустойчивость с помощью фенотипического 
          теста. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
28
3 ПЦР-идентификация локусов солеустойчивости в селекционном 
материале риса для создания солеустойчивых сортов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
30
   3.1 Результаты фенотипического теста. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
34
Заключение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
37
Список использованных источников . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 
38






     
     ВВЕДЕНИЕ

          Рис выращивается  в мире  является  из  важнейших продовольственных  культур. По  Департамента  хозяйства  за 2009  2010 год  сбор  в  составил 441,15  тонн. Это  продукт  2,5  человек в  и сотен  людей  остальных 
     Суммарный ареал  почв рисовых  систем  достигает  80 тысяч  В связи  этим  растений  засолению почвы  актуальной проблемой 
     Рис  к солеустойчивым  и значительно  урожай  при  на засоленных  и является ,  вовлекать  сельскохозяйственное использование  массивы засоленных  которые  могут  производительно задействованы  суходольные культуры.  связи  этим  солеустойчивости риса  одной из  важных.  решении  актуальной задачи  место принадлежит  сортам,  повышенной  к солевому 
     Солеустойчивость сорта  это  который  целым рядом  и их  Он  неодинаково  по годам,  и в  вегетации  и  от генотипа,  также от  условий  среды,  и биотических  Поэтому селекция  устойчивых  солевому  – довольно  задача, усложняющаяся  что  наряду  устойчивостью к  и болезням,  иметь  урожайность  качество крупы [Авакян, 2008]. В связи с развитием молекулярной биологии  в настоящее время для селекции риса широко  используются молекулярно-генетические методы с применением молекулярных маркеров. Использование молекулярных маркеров в селекции позволяет получать информацию о признаке уже на ранних стадиях развития, не дожидаясь фенотипического проявления признака, упрощает тестирование устойчивости к различным заболеваниям, требующим кропотливой оценки традиционными методами исследования [Гайнуллин, 2008].
     Цель работы: выявить локусы солеустойчивости в селекционном материале риса с помощью ПЦР-анализа для создания солеустойчивых сортов.
     Задачи работы:
     1) экстракция ДНК из селекционного материала риса и проведение ПЦР-анализа;
     2) оценка результатов практического  исследования, посвященных  ПЦР-идентификации локусов солеустойчивости риса;
     3) выявление солеустойчивых сортообразцов риса, пригодных для дальнейшей селекции.
     
     

     1 Аналитический обзор
     1.1 Биология риса (Oryza sativa)
     Рис (Oryza) – род однолетних и  растений семейства Poacea). Произрастают в  Oryza содержит 22  культурныхOryza sativa и Oryza glaberrima и 20 диких. Oryza sativa выращивают  всем мире, и  словом "рис"  именно данный  менее распространённый Oryza glaberrima– рис голый  странах Западной и  Африки. Остальные  дикорастущие, размножаются  Некоторые из них,  точечный (Oryza punctata), Рис короткоязычковый (Oryza breviligulata), произрастающие в  имеют большое  питании местного Oryzasativa имеет  экотипов (культурных  адаптированных к различным  окружающей среды.
     Oryza sativa– однолетнее  Корневая система его  длина 30 – 40 см (до ), отличается от  других злаков  воздухоносных полостей и  количеством корневых  которые у взрослого  постоянном затоплении  полностью отмирают.  1 м–  соломина,  даже 350 см– 5 м (у глубоководных  Обычно Oryza sativa формирует 3– 5 продуктивных  редком посеве и  питании – 50 и более. У  сортов стебель  прочный. Лист  влагалища и линейно-ланцетной  пластинки зелёного,  фиолетового цвета.  –   метёлка,  – 30 см. Одноцветковые  расположены преимущественно на  2-го порядка.  состоит из двух  цветковых чешуй с  остистых форм,  красный, жёлтый или  цвета, двух  плёнок –   лодикулей,  завязи и шести  Плод –  плёнчатая  округлая и широкая у  длинная и узкая у  изломе белая,  полустекловидная или мучнистая;
1000 зерновок весит 26 – 45 г [Алешин, Воробьев, Скаженник, 1995].
     
      1.2 Общие сведения о генетике риса
          Основное  хромосом рода Oryza 12. Oryza sativa, Oryza glaberrima и 14 диких  являются диплоидами с 24  восемь диких  тетраплоидами с 48 хромосомами. Род Oryza имеет  диплоидных и полиплоидных  AA, BB, CC, EE, FF, GG, BBCC, CCDD, HHJJ. Генетические  A до F, относящиеся к  рода, основаны на  конъюгации хромосом  F1. Мейоз у  растений с одинаковыми  протекает без значительных  конъюгации хромосом.  Oryza sativa считаются  диплоидные виды с  Oryza nivara и Oryza rufipogon, а предками Oryza glaberrima – африканские  виды с геномом АА Oryza barthii и Oryza longistaminata [Частная селекция…, 2005].
  
      1.3 Проблема  солеустойчивости  риса
     
      Суммарный ареал  почв рисовых  систем Кубани  почти 80 тыс. га.  осолонцевание здесь  лимитирующими факторами при  риса и сопутствующих  связи с этим  растений к засолению  является актуальной  растениеводства, привлекающей  многих исследователей и  сельского хозяйства в  необходимостью повышения  засоленных почвах.  культурных растений  свойств, в основе  лежат специфические  механизмы. Эти механизмы  своей природе и  разными уровнями  организации растений от
молекулярного до организменного.  адаптационных механизмов на  уровнях структурной  растений имеет  значение для повышения  сельскохозяйственных культур на  почвах. 
 Солеустойчивость – это генетически  признак, не имеющий  числового выражения  2001]. Различают два  солеустойчивости растений – биологическую и  биологической солеустойчивостью  сорта, понимают тот  засоления, при котором  способны завершить  онтогенетический цикл  сформировать всхожие  агрономическом же понимании  способность растений  снижению величины  структуры урожайности при  засоленной почве [Строганов, 1962].
     Вредное воздействие  растения связывают с  осмотического потенциала в  нарушением водного  избыточным поглощением и  ионов солей в  дефицитом отдельных  корневого питания в  дисбаланса ионов в  изменением гормонального  органах и тканях  [Гишева,1999]. Существует  теорий, объясняющих  растений в условиях  Согласно одной из  явление обусловливается  влиянием растворов  соответствии с другой  растений является  токсического воздействия  ионов на физиолого-биохимические  Однако в условиях  растение действуют оба  осмотический, так и токсический, но  каждого из них определяется  степенью засоления, а  реакцией растения на  стресс [Строганов,1962].
     Установлено, что одни  оказывают на растение  осмотическое действие,  обезвоживании протоплазмы  другие - токсическое, при  ухудшается обмен  Отмечено так
же, что засоление  увеличению осмотического  почвенного раствора и  ионов до опасных  Основная причина  растений при высоких  солей в корнеобитаемом  – глубокое,  нарушение  обмена  [Тулякова, 1971].        давление концентрированного  раствора на сильнозасоленных  может превышать  силу семян, в  случае семена не  влагу и некоторое  находятся как бы в законсервированном  почве. С уменьшением  почвенного раствора,  подаче на поле  результате       других  семена начинают  влагу и прорастать  1978]. 
        Исследования  токсического действия  растительную клетку показали, что ионы  проникая в клетку,  изменения, влияют на  степень дисперсии  коллоидов. Ядовитость  находится в прямой  способности их проникновения в  клеток. Соли,  проникающие и быстро  растительной клетке,  токсичны для растительного  Например, при хлоридном  почвы четко  специфические действия  хлора, которые  проникают в клетки  [Строганов, 1989]. 
         Японские  установили, что рис имеет  приспособляемость к концентрированной  среде. Причиной же  растений следует  избыточное накопление в  иона хлора, при  поглощение растением и  связано с метаболизмом 
     Результаты исследований,  рисе, также  хлор накапливался в  большем количестве, чем в  незначительное проникновение его в  органы определяется  емкостью вакуолей их  повышенной вязкостью  наконец,
существованием в растениях  барьеров, которые  проникновению этого  [Третьяков, 1988;  
          Б.П.  основании своих  пришел к выводу, что  приспосабливаются не вообще к  отдельному типу  состава почв.  солеустойчивость растений, по его  следует подразделять на  хлоридоустойчивость, содоустойчивость,солонцеустойчивость.   Солеустойчивость  обусловлена изменениями в  деятельности корневой  протяжении периода их  [Бойко, 1962]. 
         В  кущения, когда  обладают наивысшей  избытку солей в  корнях преимущественно  активный процесс  ионов, связанный с  метаболизма, который  поступление балластных  ткани растений.  поглощение солей с  током через  пространство клеточных  этот период  возрастом эта ситуация  избирательное поглощение  уменьшается, а пассивное  возрастает в результате  поверхности стенок  корней, доступной для  диффузии ионов. Это  накоплению засоляющих  тканях растений, а  более сильным  метаболизме, к торможению  развития и формирования  органов [Матухин,1963].  соотношение активного и  поглощения ионов  разных по солеустойчивости  растений и их сортов в  онтогенеза изменяется  определенной степени и  уровень устойчивости к  стрессу [Гишева,1999]. 
         Очень  засоленных землях  густые всходы  моменту появления  четырех листьев они  изреживаются. Исследования,  Туром Н.С.,  соли затрудняют  дыхание растений,  протеканию фотосинтеза. У 

происходит смена  систем от цитохромной к  затем переход к  оксидазам. В возрасте  листьев уровень  цитохромной и флавиновой  невысок и главная  принадлежит полифенольным  деятельность этих  замедляется в результате  концентрации солей,  проростки гибнут 	  
         В фазу  отличается достаточно  устойчивостью к засолению  сортовые различия по  признакам побегов, вязанных с уровнем  солевому стрессу,  незначительно [Воробьев,1990].
         Более  степень устойчивости  внешнему фактору  одной стороны,  растений сохранять  уровень метаболизма при  широком интервале  напряженности этого  т.е. обеспечивается  буферностью организма, и с  большей скоростью  защитных изменений  тогда, когда  экстремального фактора  пределы допустимой  [Удовенко, 1978]. 
         устойчивости сорта  однотипно реагируют на  солевого стресса,  отличаются как по степени  нарушений, так и по скорости и  перестройки метаболизма в  раздражитель или по скорости  нормального уровня  после прекращения  экстремального фактора  Сравнительное изучение  адаптивных реакций  воздействие различных  указывает на существование как  общих систем  устойчивости к ним. Как  ответ организма на  экстремальных факторов  последовательные стадии – стрессорную специализированную адаптацию.  первичная реакция  предотвращение 
интенсивного повреждения клеток, то в основе долговременной адаптации лежит новообразование отсутствующих ранее макромолекул и формирование механизмов специализированной устойчивости [Кузнецов, Хадыров, Рощупкин,1978].                               
         Следует сразу отметить, что физиологические реакции клеточного уровня в ответ на стрессовые воздействия исследованы несравнимо больше, чем адаптация на иных, более высоких уровнях биологической организации. При любых экстремальных воздействиях в растительном организме, как показывают многочисленные данные, наблюдаются изменения разнообразных физиологических параметров. Это обусловлено взаимосвязью отдельных процессов в растении и саморегулируемостью его метаболизма в целом [Физиологические основы…, 1995].
     
         1.4 Использование полимеразно-цепной реакции в генетических исследованиях
     Методы генетического анализа на основе ПЦР (полимеразно-цепной реакции) основаны на реализованном в 1985 году способе амплификации (размножении копий) фрагмента ДНК [Enzymatic amplification of beta-globin genomiс…,1985]. В процессе амплификации фактически повторяются естественные механизмы репликации ДНК. 
     Выделенную молекулу ДНК нагревают, затем она распадается на две нити. Добавляют праймеры. Затем смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры, при наличии в смеси ДНК искомого гена, связываются с его комплементарными участками. Далее к смеси ДНК и праймера добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. Устанавливают температуру, оптимальную для функционирования ДНК-полимеразы (температура равна 37 °С). В этих условиях, в случае комплементарности ДНК гена и праймера, происходит присоединение нуклеотидов к 3'-концам праймеров, в результате чего синтезируются две копии гена. После этого цикл повторяется снова, при этом количество ДНК гена будет увеличиваться каждый раз вдвое. Проводят реакцию в специальных приборах — амплификаторах. Процесс ПЦР отражен на рисунке 1.
     
     
     
     
     
     


Рисунок 1 —  Общая схема полимеразно-цепной реакции
           Следующий этап анализа — разделение полученных фрагментов ДНК с помощью гель-электрофореза, и получение электрофореграммы, выступающей в качестве визуального отображения генетического спектра исследуемого фрагмента ДНК, что видно из рисунка 2.

                                   

Рисунок 2 —  Результат электрофоретического разделения продуктов ПЦР
     
     Развитие науки техники сделало ПЦР-анализ доступным для реализации в условиях несложной лаборатории и широкого практического применения [Глик, Пастернак, 2002].
      
     1.5 Типы ДНК-маркеров
               
     Описание метода  без рассмотрения  ДНК-маркеров  весьма  Метод принципиально  тем, что   не  получить  спектр, но  сравнить его  некоторым  или  [Молекулярные маркеры… 2011].  возможно  использованию  – полиморфных  определяемых методами  биологии  уровне  последовательности ДНК,  каждого гена  для  участка  при сравнении  генотипов, особей,  сортов, 
         В  время разработано  количество типов  маркеров,  основаны  различных классах тельностей геномной  Они  выявлять  разнообразие  молекулярном уровне  ДНК,  является  на кото основаны все  теоретические  прикладные  При отборе  генотипов в  популяциях,  стал обычно с  проблемами, помочь  которые  ис близкосцепленных с  молекулярных маркеров, ных  методами  2010].   
        Для  применения в  очередь  эффективность  молекулярно-генетических маркеров,  на уровне  так  ДНК,  для решения  задач генетики,  сохранения ,  механизмов эволюции,  хромосом. Исследованию  использования  маркеров 
посвящено  количество  работ,  в  годы.  этих  стало  обширных  баз  ДНК-маркеров.
     Если  наиболее  типы то, в  молекулярно-генетические  можно  на  группы:  участков  генов,  аминокислотные  белков  варианты  маркеры  участков  генов и  различных  ДНК,  которых к  генам на  момент   недостаточно,  коротких   по  (RAPD   –  амплифицируемая  ДНК;  ISSR–   повторы; AFLP  –  в  рестрикции)  и  локусы  повторы с  элементарной  в 2-6 
     Микросателлиты –  это  класс  представляющих  фрагменты ДНК,  большое  – до  и даже выше –  (последовательно)  идентичных  обычно  «повторами »:  последовательностями из  ( как  принято  –  от  до  ) пар  [B?scher , Zyprian , Blaich ,  Гостимский,  Коновалов, 2005].   высокополиморфны, с  аллелей в  локусе и  темпами  Аллели  локуса  друг от  длиной,  в  числом  Небольшие  микросателлитных  позволяют  метод  цепной  в  генотипирования и  высокую  результатов в  лабораториях. Для  микросателлитов  небольшое  ДНК,   можно  даже из  деградированного  материала.  встречаются  в  количестве  у всех   эукариотов  и  используются  для  как  популяций, так и популяций сельскохозяйственных животных и растений [Гостимский, 1999].                                            На рисунке 3 можно увидеть аллели микросателлитных локусов.
     
     
     Рисунок — 3 Результат ДНК-анализа с использованием методики капиллярного электрофореза. На электрофореграмме — участок профиля коротких тандемных повторов (аллелей микросателлитных локусов)
     
          Микросателлиты используются как молекулярные маркеры  определении генетического разнообразия и родства организмов и популяций, а также для исследования процессов трансформации ДНК протекающих при эволюции и селекции.
     Микросателлиты стали удобными и предпочтительными маркерами и нашли самое широкое применение при оценке генетического разнообразия культурных растений. Научным сообществом широко используются электронные базы данных, в которых содержится актуальная информация о результатах исследования микросателлитных локусов [Butler, Reeder, 2010].
     Высокая воспроизводимость маркеров и их большая дискриминационная способность позволяет использовать их для паспортизации сортов и линий сельскохозяйственных культур [Картирование локуса Cf-б устойчивости …, 2007; Development of microsatellite markers…, 2001]. В настоящее время 
микросателлитные маркеры используются для идентификации сортов картофеля, перца, томата, пшеницы, ржи, ячменя, яблок, роз, олив и др.
           
       1.6 Локусы солеустойчивости риса
              
     По прогнозам,  солеустойчивых форм  обеспечить повышение  засоленных почвах на 2  [Ponnamperuma, 1994 ]. В связи с  создание солеустойчивых  – одно из самых  направлений в селекции.  возможности здесь  большинство признаков,  толерантность к стрессам,  несколькими QTLs с  эффектами, несмотря на  взаимодействие признаков,  формирование [Bohnert , Gong , Li , Ma , 2006]. Введение  QTLs в высокопродуктивные  стабилизирует урожайность у  проблемных почвах.  IRRI (International  Research Institute –Международный исследовательский  риса, Манила,  других мировых  центров направлены на  коллекций генплазмы  происхождения и выявление  механизмов устойчивости для их  практической селекции [Role of ABA… , 2006; Singh, Redoca, Refuerzo, 2010]. 
      Устойчивость к  разные фазы  неодинакова. Рис относительно  засолению в период  активного кущения,  чувствителен в фазу  время цветения .  засолению в фазу  репродуктивных стадиях  связана, поэтому  образцы, проявляющие эти  обеих стадиях  могут быть  стрессу в течении  периода [Comparative transcriptional profiling… , 2005].
      Наиболее  изучена устойчивость к  риса в фазу  поскольку без нее невозможно  растений на
засоленных почвах.  исследований показали, что  семян на засоленной  контролируется комплексом  Локализовано 16 QTLs  количественных признаков),  каждого из которых  фенотипической изменчивости  43,7 %), причем  (qIR-6, qIR-9,  qGP-9) определяли 30 %  признаку. В дальнейшем эти  могут быть  улучшения признака с  маркерной селекции  – marker  selection). Взаимодействие  отмечено только  двумя локусами.  полученных данных  фактом, что локусы  qGP-2 находятся в  расположения генов  описанных в более  работах [Inheritance and QTL mapping…, 2005 ]. В этом  также был выделен  риса подвида  (сорт Jiucaiqing) – источник как  минорных генов  засолению. Результаты данного  приведены в таблице 1.

Таблица 1 — Локусы количественных признаков, определяющие устойчивость к засолению у риса в фазу проростков, идентифицированные в гибридной популяции подвида indica (Jiucaiqing/ IR 26)   
Признак
Ген
Пара хромосом
Пара фланкирующих маркеров
Расстояние между маркерами, сМ
Pv,%
Потребление воды (контроль)
Через  24 ч
qIR-4
4-я
RM3687-RM3306
165,9-179,6
22,9

qIR-12
12-я
RM519-RM5609
97,8-112,3
18
Через  48 ч
qIR-2
2-я
RM5404-RM6312
167,2-185,9
4,6

qIR-3
3-я
RM49-RM6712
121,3-140,7
8,6

qIR-8
8-я
RM7356-RM7556
46,4-53,5
7,7

qIR-10
10-я
RM6691-RM3451
141,7-147,0
43,6
Доля проросших зерновок (контроль) %
Продолжение таблицы 1
Признак
Ген
Пара хромосом
Пара фланкирующих маркеров
Расстояние между маркерами, сМ
Pv,%
Доля проросших зерновок (контроль) %

Через  5 суток
qIR-4-1
4-я
RM518-RM16535
14,9-33,6
9

qIR-4-2
4-я
RM3306-RM6242
172,2-189,9
8

qIR-7-1
7-я
RM6872-RM11
15,6-31,4
16

qIR-10
10-я
RM271-RM5620
0-7,9
6,6
Через  10 суток
qIR-4-1
4-я
RM518-RM16535
15,5-29,7
10,2

qIR-7-1
7-я
RM6872-RM11
16,4-33,3
12,5

qIR-10
10-я
RM271-RM5620
0-29,8
6,6
Потребление  воды (засоление 10 суток при температуре 30 °С)
Через  24 ч
qIR-4
4-я
RМ3687-RМ3306
169,1-193,8
6,5

qIR-6
6-я
RМ276-RМ5531
16,4-22,4
33,6
Через  48 ч
qIR-9
9-я
RМ2144-RМ3320
161,2-170,3
33,7
Доля проросших зерновок (засоление, 10 суток при температуре 30 °С), %
Через  5 суток
qIR-7
7-я
RМ5623-RМ1132
40,6-50,0
9,6
Через  10 суток
qIR-2
2-я
RМ8254-RМ5804
73,1-89,1
36,5

qIR-3
3-я
RМ49-RМ6712
120,2-124,9
11,3

qIR-9
9-я
RМ219-RМ7048
54,6-66,7
47,7
Примечание. Рv — доля фенотипического варьирования признака, определяемая геном
        
         Особую актуальность исследованиям в обсуждаемой области придает тот факт, что из 12 генов, используемых для повышения устойчивости к засолению при создании трансгенных растений, четыре гена также повышают устойчивость к холоду и засухе, два — ко всем абиотическим стрессам, шесть –  к засухе  холоду [ and  approaches…,  QTL mapping  salinity…, 2007.  при  солеустойчивых образцов  только происходит  на  к  стрессовому фактору,  также создается  генов,  общую 	
          Дальнейшее увеличение  риса может  достигнуто  за  интенсификации производства  продвижения его  регионы  более  либо высокими  в зоны  засоленными  затопляемыми  К середине  изменение климата  к  средних  кроме того,  будут отмечаться  повышения  понижения  не характерные  регионов (увеличение  воздуха  вызвало  урожаев риса  тропическом климате),  уровня  расширит  находящиеся под  засоления [ Гончарова, ]  Следовательно, увеличение  культуры связано  столько  повышением  продуктивности, сколько  стабильностью урожая  комплексной  к 	 
         Таким  в условиях  неблагоприятных  изменений  в селекции  на повышение  сортов  на  формирования комплексной  к стрессам.  связи  этим  интенсивные молекулярно-генетические,   по выявлению  устойчивости,   и  базы для  разнокачественности селекционного            

         1.7 Лабораторный метод оценки солеустойчивости риса
         Лабораторный метод оценки выполняется следующим образом. 50 семян с целью уничтожения грибковой микрофлоры обрабатывают 12 % перекисью водорода в течении 15 минут. Для одинаковой проницаемости покровных оболочек зерновок у разных сортов, на начало роста проростков в условиях засоления, их  16-17 часов  дистиллированной  в  при температуре  оС Затем  раскладывают   чашки Петри  фильтровальной бумаге,  смоченной  мл  % NaCl накрывают крышкой,  исключить  воды.  исследуемые образцы  термостате при  29 С  течение 4  На пятые  отбирают  типичных  с каждого  и определяют  массу  точностью  0,01 г. 
        устойчивым сортам  формы,  проростков  по отношению  сорту-стандарту Курчанка  более  К  относят образцы,  которых масса  составляет  К  относят формы,  проростков которых  отношению  сорту-стандарту  менее 80% Скаженник,  Досеева 2009.  

        1.8 Конечный метод оценки риса на солеустойчивость

         Окончательную  сортов и  риса проводят  условиях  опыта  выращивании растений  засоленной и  (контроль  почве.  устойчивости образцов  по снижению  зерна  %  и изменению  признаков в  засоления  контрольного  Установлено, что  метода можно  почти  при  контрольного варианта.  урожайности у  с  по  вегетационным периодом  невелико, тогда  по  к  оно на  выше. Это  оценивать  только  варианте с  в почве,  их  известным  сортом –  Таким для  края  сорт .   
        Почву отбирают с типичных участков рисовой оросительной системы, просеивают через сито для удаления крупных комков и растительных остатков. Сосуды емкостью  или 8  заполняют  За  дня до  риса вносятся  удобрения:  двузамещенный  кальция, хлорид  из расчета: - ,5 P- ; K мг  на  г почвы.  тщательно перемешивают  Искусственное  почвы  расчета 0,25  на сухую  массу  путем  в почву . При  верхний  почвы  см оставляют  до получения  Посев  семенами  18-30 штук  сосуд. В  всходов  3  ) проводят  растений с  6-10  на  После прореживания  опускают в  резервуары,  водой,  минерализация в  поддерживается на  0,25  в  вегетации. В  цветения риса  минерализации  понижают  0, 2  Погружение сосудов  воду  устранить  перегревание, упрощает  за минерализацией  и  равномерное  последних по  площади. 
        К  относят  урожай  по отношению  сорту -  составляет  %  выше. К  и среднеустойчивым  образцы,  которых  составляет соответственно  65-84%; к  и  64-65  менее 45  соответственно [, ,  2005]  







       
        

          2 Материал и методы исследований
     
     Данная работа была проведена на базе лаборатории ФГБНУ «ВНИИ риса» , поселок Белозерный Краснодарского края, в период с 15 июня по 27 июля , с 1 сентября по 11 октября 2015 года.
     
          2.1 Объект исследования
     
         Объектом исследований послужило 28 сортов и сортообразцов  российской и казахстанской селекции: Маржан , Курчанка, Ба?анас, Кубань 3, НВ9093, НВ9106, НВ9114, Лидер, Янтарь, Фишт, Анаит, , Мадина, Акдала, Шарм, Изумруд, Новатор; а также потомства разных  поколений от гибридных комбинаций этих генотипов:  F2 ? Маржан  x    ? НВ9106,    F4 ?  Маржан  x  ?  Курчанка  var. Vulgaris, F4 ?  Маржан   x ?  Курчанка  var. zeravschanica,  F4 ?  Маржан  x ?  Курчанка  var. italica, F3 ?  Регул x ?  Курчанка  var. italica, F3 ?  Регул x  ?  Курчанка  var. zeravschanica, F4 ?  Соната  x ?  Лиман   var. italica, 15 F4 ?  Соната  x  ?  Лиман   var. nigroapiculata,  F4 ?  Баканасский  x    ?  Аналог 2  var. nigroapiculata,  F3 ?  Дарий 23 x ?  Аналог 2    var. italica, F4  ?  Ханкайский 429   x ?  Курчанка  var. zeravschanica,  F4 ?  Кубань3 x ?  Кол.?лгі  34-09 var. zeravschanica.
          При этом в качестве положительного контроля использовали следующие сортообразцы: Маржан - казахстанский солеустойчивый стандарт,  Курчанка-  РФ стандарт по солеустойчивости .
       Также в экспериментах проводилась идентификация количественных локусов солеустойчивости (Saltol) QTLs: SalTol 1, SalTol 2.

          2.2 Растворы и буферы. Оборудование
         Растворы и буферы, которые использовались для проведения лабораторных опытов: TBE - Tris/Borate/EDTA – буферный раствор,
содержащий смесь трис-основания, борной кислоты и ЭДТА; CTAB - ЦТАБ - Цетилтриметиламмоний бромид; dd Н2О – дважды дистиллированая очищенная вода; термостабильная ДНК-полимераза – Thermus aquaticus (Taq-полимераза); dNTP mix – смесь дезоксирибонуклеозидфосфатов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP); 10x buffer – р-р сульфатов и бычий сывороточный альбумин; краситель – динитрофенол. Все реактивы приготовлены фирмой «SibEnzyme».
         Лабораторные опыты проводили с использованием следующего оборудования: ДНК-амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Москва), 
камеры для вертикального электрофореза VE-3 (Helicon, Москва), спектрофотометр UV-2550PC (Shimadzu, Япония), микроцентрифуга «MiniSpin» (Eppendorf, Германия),  термостат «Термо 24» (Biokom, Россия).
   
          2.3 Подготовка растительного материала и экстракция ДНК

     Для выделения ДНК использовали бесхлорофилльные семидневные проростки, получаемые путем инкубации на увлажненной фильтровальной бумаге в темноте, при температуре 25-27оС.
          Экстракцию ДНК из растительного материала проводили СТАВ-методом [Мюррей, Томпсон, 1980] по следующей схеме.
Образцы вносили в микропробирки и растирали с прогретым до 60оС  2 x СТАВ буфером, содержащим 2% СТАВ (цетилтриметиламмоний бромид), 1,4М хлористого натрия, 0,1М Трис-гидрохлорид, 20 мМ ЭДТА (этилендиаминотетраацетат). При этом соблюдали соотношение 500 мкл буфера на 0,1 г ткани. Образцы инкубировали 4 часа при 60оС, после чего вносили равный объем хлороформа и инкубировали при перемешивании в течение 20 минут. На следующем этапе образцы центрифугировали 10 минут при 5000 об/мин, отбирали супернатант и добавляли к нему  5 x СТАВ буфер,
содержащего 5%  и 350  ЭДТА,  инкубировали  минут при оС.  инкубации  пробирки  образцами вносили  объем хлороформа  инкубировали  перемешивании  минут, центрифугировали  минут при  обмин отбирали верхнюю  в чистую  добавляли  объем  для преципитации  СТАВ, 50  Трис-HCI 10  ЭДТА) и  на ночь  комнатной  После  ДНК осадок  в 500  солевого  (1М , 10  Трис-HCI 1  ЭДТА),  1 мл  этилового спирта   инкубировали  комнатной  от двух  трех часов.  истечении  времени  образцы 10  при 13000 /,  чего осадок  70% этиловым  высушивали  растворяли  50 мкл  дистиллированной воды.   выделенной  определяли  на спектрофотометре  производства Shimadzu  по  методике Маниатис , , Сэмбрук 1984,   также методом  полученных препаратов  последующим  электрофорезом  2% агарозном  содержащем 1мкг/мл  этидия  визуализацией  ультрафиолете. При  исходили из  что  чувствительности  этидия в  гелях составляет  нг  [Остерман, 
     
         2.4 Полимеразная цепная реакция
         Для идентификации локусов солеустойчивости риса использовался метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
       Для проведения ПЦР требуются следующие компоненты:
1. ДНК-матрица;
     2.Два праймера, комплементарные противоположным концам требуемого
2. фрагмента ДНК;
3.  ДНК-полимераза –  который  реакцию  ДНК –  aquaticus (-полимераза);
4.  дезоксирибонуклеозидтрифосфатов dATP, , dCTP dTTP
5. Ионы  необходимые для  полимеразы;
6. 10x ,  необходимые  реакции – , ионную  раствора.  сульфаты,  сывороточный альбумин.
7.  маркеры: RM AP RM
        Образец для  ПЦР представлял  ДНК,  из  или десяти  проростков одного  или  взятых  эквимолярном количестве.  амплификации выделенной  использовались ,  компанией ЗАО Синтол» 
    ПЦР  с  нг ДНК  конечном объеме  мкл.    следующий  реакционной смеси: 	 мМ дезоксирибонуклеозидфосфа,   0,3    каждого праймера 25  м  KCL  60 M   TrisHCL  (  8,5),    Тритон    10  мМ   1,5 мМ 2 1  Taq-полимеразы. 
        осуществляли при  условиях:               денатурация  при 94С -  минуты.  
 Следующие  циклов: 
* 1  -денатурация  94С,
*  минута -  праймеров при 0 
* 1  элонгация при 0 С 
3.Последний  синтеза  минут  при  0С.
         
         2.5 Электрофорез

        Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР использовали 8%
полиакриламидный гель  основе 1  Трис-боратного  (0,09  Трис,  Борной кислоты,  мМ  рН  Электрофорез проходил  напряжении 220V  течение  мин  камерах для  электрофореза VE-3  Helicon  После  электрофореза гелевые  помещали на  мин  раствор  этиди.......................